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實時熒光定量PCR原理及基礎(chǔ)知識

  • 發(fā)布日期:2019-04-28      瀏覽次數(shù):9228
    • 什么是實時熒光定量PCR (RT-PCR,qPCR)?

      實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)指的是在PCR進行的同時,對其過程進行監(jiān)測的能力(即實時)。因此,數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中,而非PCR結(jié)束之后,進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實時熒光定量PCR (qPCR)中,反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴增的時間點為特征,而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計的擴增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反,終點法檢測(也稱 “讀板檢測”)測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。

       

      關(guān)于序列檢測試劑

      概述

      我們開發(fā)了兩種通過使用序列檢測系統(tǒng)(SDS)儀器進行PCR產(chǎn)物檢測的試劑:

      • Applied Biosystems™ TaqMan® 試劑(也稱“熒光5’核酸酶試劑”)
      • Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料試劑

      TaqMan方法

      TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測。

      使用TaqMan方法的檢測類型

      TaqMan方法可用于以下檢測類型:
      定量,包括:

      • 用于RNA定量的一步法RT-PCR
      • 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
      • DNA/cDNA定量
        • 等位基因檢測
        • 通過IPC進行的正負檢測

       SYBR Green I染料試劑

      SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems™ SYBR™ Green I染料,一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區(qū)別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA,包括非特異性的反應(yīng)產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過特別優(yōu)化的反應(yīng)體系,對于獲取準(zhǔn)確的結(jié)果而言是非常必要的。

      使用SYBR Green I染料法的檢測類型

      SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型:

      • 用于RNA定量的一步法RT-PCR
      • 用于RNA定量的兩步法RT-PCR
      • DNA/cDNA定量

      TaqMan試劑

      背景

      初,使用嵌入式染料進行實時熒光PCR (qPCR) 產(chǎn)物定量。但這些染料存在重大缺點,即會同時檢測特異性以及非特異性PCR產(chǎn)物的擴增量。

      TaqMan方法的開發(fā)

      通過引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的熒光標(biāo)記探針,實時定量PCR系統(tǒng)得到了顯著提升。這些熒光探針的使用,使得實時定量的方法得到了發(fā)展,實現(xiàn)了僅對特定擴增產(chǎn)物的檢測。此外,熒光標(biāo)記探針的開發(fā),也免去了用于探針降解分析的PCR反應(yīng)后處理過程。

      TaqMan序列檢測方法的工作原理

      TaqMan試劑通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測。工作原理:

      步驟、過程

      1. 構(gòu)建一段寡核苷酸探針:5’端標(biāo)記熒光染料報告基團,3’端標(biāo)記淬滅染料基團。當(dāng)探針保持完整時,淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)而顯著降低由報告染料基團發(fā)射的熒光。
      2. 如果存在目標(biāo)序列,探針便會在其中一個引物結(jié)合位點的下游發(fā)生退火,并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性,完成切除。
      3. 探針的切除將會引起:
        • 將報告染料基團和淬滅染料基團進行分離,增強了報告染料基團的信號。
        • 將探針從目的鏈上去除,使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸。因此,探針的介入并不會抑制整個PCR過程。
      4. 每經(jīng)過一個循環(huán),就會有更多的報告基因染料分子從各自的探針上切斷,熒光強度會隨著合成的擴增片段數(shù)量的增加而增加。

      兩種類型的 TaqMan 探針

      我們可提供兩種類型的Applied Biosystems™ TaqMan® 探針:

      • TaqMan探針(含有Invitrogen™ TAMRA™染料——淬滅染料基團)
      • Applied Biosystems™ TaqMan® MGB探針

      推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針

      我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進行等位基因分型分析,特別是當(dāng)傳統(tǒng)TaqMan探針超過30個核苷酸時。TaqMan MGB探針包含:

      • 位于3 '端的非熒光淬滅基團——由于淬滅基團不發(fā)出熒光,因此SDS儀可以更地檢測出報告基因染料 。
      • 位于3’ 端的小溝結(jié)合物 – 小溝結(jié)合物可提高探針的熔解溫度(Tm),縮短探針的長度。

      終,TaqMan MGB 探針會在匹配和未匹配探針之間展現(xiàn)出更大的 Tm 值差異,從而提供更準(zhǔn)確的等位基因分型。

      TaqMan 方法的優(yōu)點

      TaqMan方法的優(yōu)點如下:

      • 需要在探針和目標(biāo)分子(靶點)之間發(fā)生特異性的水解(雜交),方可生成熒光信號
      • 您可使用明顯不同的報告基因染料標(biāo)記探針,在一個反應(yīng)管內(nèi)擴增并檢測兩個不同的序列
      • 無需PCR后處理,減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

      TaqMan方法的缺點:

      TaqMan方法的主要缺點在于需要根據(jù)不同的序列,合成不同的探針。

       

      SYBR Green I染料試劑

      背景

      一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合的小分子分為以下兩類:

      • 嵌入劑
      • 小溝結(jié)合物

      無論哪種結(jié)合方法,用于PCR實時檢測的DNA結(jié)合染料都需要滿足以下兩個條件:

      • 結(jié)合至雙鏈DNA時,會有增強的熒光
      • 對 PCR 不會產(chǎn)生抑制

      我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件,使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產(chǎn)生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。

      SYBR Green I染料法的工作原理

      SYBR Green I染料法通過SYBR Green I染料與PCR過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合,而對聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物進行檢測。工作原理:

      步驟、過程

      當(dāng)SYBR Green I染料被加入到樣品中后,它可立即與樣品中的雙鏈DNA進行結(jié)合 。

      1. 在PCR過程中,Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™DNA聚合酶可對目標(biāo)序列進行擴增,以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物,即“擴增子”。
      2. 隨后,SYBR Green I染料會與每一個新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進行結(jié)合。
      3. 隨著PCR的進行,越來越多的擴增子被生成。由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合,因此熒光強度也會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加。

      SYBR Green I染料法的優(yōu)點

      SYBR Green I染料法的優(yōu)點如下:

      • 它可用于監(jiān)測任何雙鏈 DNA 序列的擴增。
      • 無需探針,降低了檢測的設(shè)置和運行成本。

      SYBR Green I染料法的缺點:

      SYBR Green I染料法的大缺點在于可能會產(chǎn)生假陽性信號;即,因為SYBR Green I染料可與任何的雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合,因此也會與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結(jié)合。

      其他注意事項

      采用DNA結(jié)合染料的另一原因,是多重染料與單一擴增分子的結(jié)合。這可提高擴增產(chǎn)物檢測的靈敏度。基于多重染料的結(jié)合,將迎來信號量取決于在反應(yīng)中所產(chǎn)生的雙鏈DNA量的局面。因此,如果擴增效率相同,相較于對較短產(chǎn)物的擴增,對較長產(chǎn)物的擴增將會產(chǎn)生更多的信號。這*不同于熒光探針,使用熒光探針時,對于每個合成的擴增分子淬滅僅釋放一個熒光基團,與其長短并不相關(guān)。

       

      關(guān)于定量檢測

      什么是定量檢測?

      定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量(定量)每輪PCR擴增循環(huán)中,檢測目標(biāo)核酸片段的量。目標(biāo)分子可以為DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要對以下三種定量檢測進行討論:

      • DNA/cDNA定量
      • 采用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的RNA定量
      • 采用兩步法RT-PCR的RNA定量

      定量分析常見術(shù)語

      擴增子:PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段
      擴增曲線:根據(jù)熒光信號相對于循環(huán)數(shù)而制作的曲線
      基線:PCR起始時,熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)
      Ct(閾值循環(huán)):熒光信號超過NTC(無模板對照樣品)固定閾值時的循環(huán)數(shù) 。用于對擴增質(zhì)量進行驗證。
      核酸目標(biāo):(也稱為“目標(biāo)模板”)——需要擴增的DNA或RNA序列
      惰性參比染料: 一種可作為內(nèi)部對照,以用于在數(shù)據(jù)分析時對報告基團染料信號進行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進行的必要校正。所有的SDS PCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
      Rn(均一化報告基團):報告基團染料釋放的熒光強度除以惰性參比染料釋放的熒光強度
      Rn+: 一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分,包括模板
      Rn-:未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲取:

      • 實時熒光定量PCR (qPCR) 運行的早期循環(huán)(產(chǎn)生可被檢測的熒光信號之前的循環(huán)),或
      • 不含有任何模板的反應(yīng)

      ΔRn (delta Rn): 在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。
      ΔRn可通過以下公式計算:(Rn+) – (Rn-)標(biāo)準(zhǔn)品 具有已知濃度的A樣本,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,您可構(gòu)建用于未知樣品定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
      閾值:早期PCR循環(huán)時Rn值的平均標(biāo)準(zhǔn)差,乘以相應(yīng)的校正系數(shù)閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)定在PCR指數(shù)擴增時的相關(guān)區(qū)域。
      未知:具有未知模板量的樣品。即,您需要進行檢測的樣品。

      實時PCR (qPCR) 定量檢測工作原理

      在PCR的起始循環(huán)中,熒光信號幾乎不發(fā)生變化。從而定義為擴增曲線中的基線。而超出基線部分的熒光的增加,則為對累計目標(biāo)分子的檢測。固定的熒光閾值線,可設(shè)置在基線之上。熒光超過固定閾值時的循環(huán)數(shù)則為參數(shù)CT(閾值循環(huán))。

       

      與相對定量

      概述

      當(dāng)對定量檢測的結(jié)果進行計算時,可以采用或相對定量。

      什么是定量?

      定量檢測是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行的定量。

      示例

      定量可根據(jù)病毒的拷貝數(shù),監(jiān)控疾病狀態(tài)。研究者須知道特定生物學(xué)樣品中目標(biāo)RNA分子的準(zhǔn)確拷貝數(shù),以對疾病的進展進行監(jiān)測。定量可通過從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)進行,但注意標(biāo)準(zhǔn)品的定量則須首先通過其他方法獲取。

      什么是相對定量?

      相對定量用于分析特定樣品相對于參照樣品(比如,未處理的對照組)某個基因表達量的變化。

      示例

      相對定量可用于檢測化合物(藥物)引起的基因表達改變。經(jīng)化學(xué)處理樣品中的特定目標(biāo)基因的表達水平可與相對未處理樣品中的基因表達水平進行比較。

      相對定量的計算方法

      相對定量可根據(jù)從所有SDS儀器獲取的數(shù)據(jù)而進行。用于相對定量的計算方法有:

      • 標(biāo)準(zhǔn)曲線法
      • 比較CT法

      確定使用哪種方法 所有方法都可產(chǎn)生同等的結(jié)果。當(dāng)在確定使用哪種方法時,需要注意:

      • 在不同的反應(yīng)管中進行目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照的擴增時,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行分析,所需優(yōu)化和驗證操作少。
      • 采用比較CT法時,則須進行驗證實驗,以表明目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照擴增的效率基本相同。比較CT法的優(yōu)勢在于無需標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而可以實現(xiàn)通量提高(因為無需額外的孔用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制);并消除在進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時因稀釋錯誤所帶來的不利結(jié)果。
      • 如需將靶標(biāo)和內(nèi)源性對照品在同一管內(nèi)進行擴增,則須優(yōu)化并限制引物的濃度以避免對 CT 值產(chǎn)生影響。當(dāng)在一管中進行雙重反應(yīng)時,可以提高通量并減少移液失誤所帶來的不利影響。

      常用術(shù)語

      和相對定量中常用的術(shù)語,如下:

      標(biāo)準(zhǔn):用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度樣品。
      參考文獻:用于對實驗結(jié)果進行均一化的陰性或陽性信號。內(nèi)源性和外源性對照是常見的陽性對照。陽性對照指的是因 PCR擴增 而產(chǎn)生的信號。陽性對照則具有自己的引物和探針組合。
      內(nèi)源性對照:指的是,在每個樣品進行提取時便已存在于樣品中的RNA或DNA。當(dāng)采用內(nèi)源性對照作為陽性對照時,您可通過對信使RNA(mRNA)的均一化定量來消除每次反應(yīng)中加入的總RNA量的差異。
      外源性對照:指的是,在每個樣品中加入的具有已知濃度的特殊RNA或DNA。外源性陽性對照通常是來自可以作為內(nèi)部陽性對照(IPC)的體外成分,可區(qū)分真正的目標(biāo)陰性和PCR抑制。此外,外源性對照還可均一化樣品提取或逆轉(zhuǎn)錄中互補DNA(cDNA)合成的效率差異。無論是否使用陽性對照,使用含有ROX染料的參比熒光對照都是十分重要的,因為它可以對非PCR相關(guān)的熒光信號波動進行均一化。
      目標(biāo)分子的均一化量:一個可以用于比較不同樣品中目標(biāo)分子相對量的無單位數(shù)字。
      校準(zhǔn)品:可以用作比較結(jié)果基礎(chǔ)的樣品。

       

      用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法

      概述

      因采用的是相對于基礎(chǔ)樣品的表達量,例如校準(zhǔn)品,用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線一般都比較容易繪制。對于所有的實驗樣品,其目標(biāo)分子的量均是從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取,然后除以校準(zhǔn)品的目標(biāo)分子量而確定的。因此,校準(zhǔn)品便成為1 X 樣品,而所有其他的量則都為以n倍校準(zhǔn)品來表示。例如,在研究藥物對表達產(chǎn)生的影響時,未處理的對照樣品便是合理恰當(dāng)?shù)男?zhǔn)品。

      關(guān)鍵指南

      以下指南可為相對定量中標(biāo)準(zhǔn)曲線的正確使用,提供關(guān)鍵指導(dǎo):

      • RNA或DNA儲存液的準(zhǔn)確稀釋是十分重要的,但用于表達稀釋的單位是無關(guān)的。如果對來自對照細胞系的總RNA進行了2倍的稀釋后進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,則單位應(yīng)該是稀釋值1、0.5、0.25、0.125等。如果使用相同的 RNA 或 DNA 儲存液進行不同板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,則可在不同板之間比較確定的相對定量。
      • 也可使用DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線進行RNA的相對定量。這么做需要假設(shè)目標(biāo)分子在所有樣品中的逆轉(zhuǎn)錄效率都是相同的,但并不需要知道效率的值。
      • 在采用內(nèi)源性對照進行定量均一化時,應(yīng)該對目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照都進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。對于每一個實驗樣品,目標(biāo)分子和內(nèi)源性對照的量都是根據(jù)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線而確定的。因此,目標(biāo)分子的量除以內(nèi)源性對照的量便是均一化后的目標(biāo)分子值。同樣的,其中的一個實驗樣品便是校準(zhǔn)品,或1×樣品。每一個均一化的目標(biāo)分子值除以校準(zhǔn)品的均一化值后便是相對的表達水平。

      內(nèi)源性對照

      對于內(nèi)源性對照進行擴增可用于對加入至反應(yīng)的樣品RNA或DNA的量進行標(biāo)準(zhǔn)化。對于基因表達定量,研究者采用過 ß-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核糖體RNA(rRNA)或其他RNA作為內(nèi)源性對照。

      標(biāo)準(zhǔn)品

      由于樣品量會除以校準(zhǔn)品的量,則標(biāo)準(zhǔn)曲線中的單位便被去除了。因此,對于標(biāo)準(zhǔn)品來說所有需要知道的只是它們的相對稀釋比。對于相對定量,任何含有合適目標(biāo)分子的RNA或DNA儲存液都可用作標(biāo)準(zhǔn)品。

       

      用于相對定量的比較CT法

      比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似,只是它利用的是算術(shù)公式2−ΔΔCT來獲取相同的相對定量結(jié)果。

      算術(shù)公式:

      為了有效地利用比較 CT 法,目標(biāo)分子(基因)和對照(內(nèi)源性對照)的擴增效率應(yīng)當(dāng)近似相同。 
      更多關(guān)于使用比較CT法進行相對定量的信息,請參閱用戶手冊#2:基因表達的相對定量(PN4303859)。

       

      用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法

      概述

      用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法與用于相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法類似,只是標(biāo)準(zhǔn)品的量必須首先通過其他獨立方法獲取。

      關(guān)鍵指南

      下面的指南對于定量中標(biāo)準(zhǔn)曲線的正確使用十分關(guān)鍵:

      • 來自單一、純凈物種的DNA或RNA是十分重要的。例如,從大腸桿菌制備的質(zhì)粒DNA通常都會存在RNA的污染,這會增加A260的讀數(shù)而增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)計算結(jié)果。
      • 準(zhǔn)確的移液是必需的因為標(biāo)準(zhǔn)品需要經(jīng)過不同的數(shù)量級的順序稀釋。質(zhì)粒DNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA必須被濃縮以便獲取準(zhǔn)確的A260測量值。濃縮的DNA或RNA隨后必須被稀釋106–1012倍以獲得與生物學(xué)樣品中目標(biāo)分子相似的濃度。
      • 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性也需要引起注意,特別是對于 RNA。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分裝至多份,儲存在-80°C,并僅在使用前才進行解凍。

       無法使用DNA作為RNA定量的標(biāo)準(zhǔn)品,因為對于逆轉(zhuǎn)錄過程的效率沒有對照。

      標(biāo)準(zhǔn)品

      標(biāo)準(zhǔn)品的量必須首先通過其他獨立的方法獲取。質(zhì)粒 DNA 和體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 通常用于制備標(biāo)準(zhǔn)品。濃度可在A260 處被測量得到,并通過使用DNA或RNA的分子量轉(zhuǎn)化成拷貝數(shù)。

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